Marek Wiergowski, Krystyna Reguła, Beata Szpiech
Szybka analiza amfetaminy w ludzkim materiale biologicznym z wykorzystaniem
metody mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej w fazie nadpowierzchniowej
Z Katedry i Zakładu Medycyny Sądowej AM w Gdańsku
p.o. Kierownik: dr hab. Z. Szczerkowska - profesor AM
Oznaczanie amfetaminy dla celów sądowo-lekarskich wymaga opracowania szybkiej
i miarodajnej procedury analitycznej uwzględniającej właściwości fizyko-chemiczne
amfetaminy oraz szczególny rodzaj materiału biologicznego (często będącego w
stanie znacznego rozkładu gnilnego). W toku badań stwierdzono kilkukrotny wzrost
czułości dla amfetaminy badanej z wykorzystaniem metody mikroekstrakcji do fazy
stacjonarnej (SPME) w fazie nadpowierzchniowej w stosunku do tradycyjnej metody
analizy w fazie nadpowierzchniowej. Ponadto opracowana procedura charakteryzuje
się krótkim czasem analizy, prostotą, zadowalającą dokładnością oraz ograniczeniem
wpływu związków utrudniających miarodajne oznaczenie końcowe. Wykazano przydatność
analizy amfetaminy w materiale biologicznym z wykorzystaniem metody SPME w fazie
nadpowierzchniowej.
Słowa kluczowe: amfetamina, mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej w fazie nadpowierzchniowej,
ludzki materiał biologiczny, chromatografia gazowa
Oznaczenie amfetaminy w materiale biologicznym należy do często przeprowadzanej
analizy w toksykologii sądowej. Przy czym istotne znaczenie ma nie tylko szybkość
analizy, ale również czułość oraz granica wykrywalności oznaczeń. Yashiki i
współpracownicy (4) w 1995 roku opublikowali dane dotyczące oznaczenia amfetaminy
w moczu metodą mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej w fazie nadpowierzchniowej
(ang. Head Space - Solid Phase Microextraction, HS-SPME). Podstawy metodyczne
techniki mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej wprowadził i opracował profesor
Janusz Pawliszyn, absolwent Politechniki Gdańskiej oraz jego współpracownicy
z "The University of Waterloo" w Kanadzie (2, 3). Przedmiotem niniejszego opracowania
jest wstępna praca teoretyczna i doświadczalna dotycząca szybkiej analizy amfetaminy
z wykorzystaniem mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej w fazie nadpowierzchniowej
w ludzkim materiale biologicznym: we krwi i w moczu.
Urządzenie do SPME ma kształt zbliżony do strzykawki. Najważniejszym jego
elementem jest włókno kwarcowe pokryte fazą stacjonarną. Procedura analityczna
SPME obejmuje zasadniczo dwa podstawowe etapy (uproszczony schemat procedury
przedstawiono na ryc. 1). W pierwszym etapie (ryc. 1.a) włókno jest doprowadzane
do kontaktu z próbką w fazie gazowej (lub w fazie ciekłej), w wyniku czego dochodzi
do sorpcji analitów. W drugim etapie (ryc. 1.b) włókno jest wystawiane na działanie
wysokiej temperatury w gorącym dozowniku chromatografu gazowego, a uwolnione
anality przenoszone są do kolumny chromatograficznej.
Wyboru odpowiednich parametrów w SPME dokonuje się biorąc pod uwagę takie
właściwości jak: lotność, polarność i masa cząsteczkowa analitów, złożoność
składu chemicznego próbki czy współczynnik podziału analitu. Współczynnik podziału
można w pewnym zakresie zmieniać przez modyfikację składu próbki, przy czym
dobre efekty uzyskuje się przez dodatek soli (wzrost siły jonowej roztworu)
bądź zmianę pH próbki. Czułość metody SPME można również zwiększyć przez zastosowanie
grubszego filmu fazy stacjonarnej, co powoduje niestety wydłużenie czasu uzyskania
równowagi w układzie. Stosowanie grubszego filmu wiąże się także z wydłużonym
czasem kondycjonowania włókna i desorpcji termicznej analitów w dozowniku chromatografu
gazowego. Włókna o grubym filmie fazy stacjonarnej (np. 100 ľm) są bardziej
przydatne do analizy związków lotnych (o temperaturze wrzenia do ok. 200°C),
choć mogą być również użyte do związków mniej lotnych, ale wówczas czas ustalenia
się równowagi jest dłuższy.
Amfetamina w postaci wolnej aminy jest bezbarwną cieczą o temperaturze wrzenia
od 200°C do 203°C, przy czym absorbując dwutlenek węgla z atmosfery tworzy
lotny związek - węglan amfetaminy (1). Zgodnie z zasadą, że "podobne rozpuszcza
się w podobnym" do analizowania związków o charakterze polarnym odpowiedniejsza
jest faza bardziej polarna. W przypadku, gdy anality są związkami lotnymi lub
mają wysoki współczynnik podziału, a badana próbka jest ciałem stałym lub cieczą
o dużej zawartości związków organicznych o dużych masach cząsteczkowych,
lepszą techniką, z punktu widzenia czułości metody, jest SPME z fazy nadpowierzchniowej.
Unika się wówczas "zablokowania" włókna przez związki organiczne, a czas konieczny
do uzyskania stanu równowagi jest znacznie krótszy. Wynika to z faktu, że dyfuzja
w gazach zachodzi czterokrotnie szybciej niż w fazie wodnej. Taki przypadek
odnosi się do oznaczania amfetaminy w materiale biologicznym.
MATERIAŁ I METODA
Procedura szybkiej analizy amfetaminy (ryc. 2) wymaga wstępnie kondycjonowania
włókna SPME (100 ľm, PDMS, "Supelco") w gorącym dozowniku chromatografu gazowego
przez czas konieczny do oczyszczenia włókna, czyli w praktyce od pół godziny
do nawet kilku godzin. Dopiero po tym etapie można przystąpić do przygotowania
próbki moczu i krwi do analizy końcowej. Do szklanego naczyńka przeniesiono
po 1 ml próbki, dodano wzorzec amfetaminy oraz roztworu węglanu potasu. Zamknięto
szczelnie naczyńko i wymieszano zawartość. W trakcie termostatowania próbki
amfetamina jest uwalniana do fazy nadpowierzchniowej. Po 20 min włókno SPME
wprowadza się do fazy nadpowierzchniowej wewnątrz naczyńka i eksponuje przez
5 min. Termiczna desorpcja analitów w gorącym dozowniku chromatografu gazowego
uwalnia substancje, które są dalej rozdzielane i oznaczane w układzie chromatograficznym
GC-FID.
WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
Krzywe kalibracyjne zawartości amfetaminy we krwi i moczu wyznaczone
omawianą metodą dostarczają informacji o liniowości odpowiedzi detektora płomieniowo-jonizacyjnego
wynoszącej około 0,96 (ryc. 3). Przy czym zastosowanie dodatku wzorca wewnętrznego
może poprawić wartość współczynnika korelacji liniowej R
2. Uwzględniając
wartość tła w trakcie analizy chromatograficznej oraz na podstawie krzywych
kalibracyjnych obliczono stężenia granicy wykrywalności i oznaczalności amfetaminy
we krwi i moczu (tabela I). Porównanie tych wartości ze stężeniami toksycznymi
i śmiertelnymi (1) wypada na korzyść prezentowanej metody, co pozwala na wykorzystanie
jej w praktyce toksykologicznej. Precyzję badanej procedury dla sześciu pomiarów
próbek moczu z dodatkiem amfetaminy (stężenie amfetaminy - 10 ľg/ml) określono
jako 17% względnego odchylenia standardowego.
Tabela I. Granica wykrywalności i oznaczalności amfetaminy.
Materiał biologiczny
Biological material
|
Granica wykrywalności
Detection limit
ľg/ml
|
Granica oznaczalności
Determination limit
ľg/ml
|
krew* blood
|
0,15
|
0,30
|
mocz urine
|
0,05
|
0,10
|
* Stężenie amfetaminy we krwi (1): lecznicze - od 0,05 do 2 ľg/ml, toksyczne
- od 1 do 3 ľg/ml i śmiertelne - ponad 0,5 ľg/ml
(średnio 8,6 ľg/ml)
WNIOSKI
-
W pracy wykazano przydatność metody SPME do badania zawartości amfetaminy
w krwi i moczu. Zastosowana metoda pozwala na kilkukrotny wzrost czułości
oznaczenia amfetaminy w stosunku do tradycyjnej metody analizy w fazie
nadpowierzchniowej.
-
Do zalet metody SPME należy zaliczyć ograniczenie ilości koniecznych operacji
analitycznych. Tym samym istnieje mniejsze ryzyko popełnienia błędu grubego
i systematycznego, a dodatkowo znacznie skraca się czas analizy.
-
Metoda jest prosta a jej koszty są relatywnie niskie. W odróżnieniu od
innych metod wzbogacania analitów, w metodzie SPME całkowicie wyeliminowano
zużycie drogich i toksycznych rozpuszczalników. Ponadto charakteryzuje się
ona ograniczeniem wpływu związków utrudniających miarodajne oznaczenie końcowe.
-
Metoda SPME wymaga jednak stosunkowo częstej kalibracji oraz szczególnej
dbałości o czystość włókna sorpcyjnego. W celu uzyskania powtarzalnych wyników
metodą SPME konieczne jest dokładne kontrolowanie i odtwarzanie parametrów
procesu sorpcji i desorpcji analitów z włókna.
PIŚMIENNICTWO
1. Moffat A.C., Jackson J.V., Moss M.S., Widdop B., Clarke's isolation and
identification of drugs in pharmaceuticals, body fluids, and post-mortem material,
The Pharmaceutical Press, London, 1986. -2. Pawliszyn J., Application of Solid
Phase Microextraction, The Royal Society of Chemistry, Cambrige, 1999. -3. Pawliszyn
J., Solid Phase Microextraction. Theory and Practice, Wiley-VCHC.L., Toronto
1997. -4. Yashiki M.T., Koyima T., Miyazaki N., Nagasawa Y., Iwasaki, Hara K.,
Fast, accurate detection of amphetamines in urine, using solid phase microextraction/capillary
GC, Forensic Science International, 1995,76, 169-177.
Adres pierwszego autora:
Katedra Medycyny Sądowej AM
ul. Skłodowskiej-Curie 3A
80-210 Gdańsk
Komentarze
calkiem ciekawa strona ale mnie bardziej interesuje sklad amtetaminy(chemiczny - dokladny) i sposob jej produkcji a nie powieszchowne informacje na temat objawów zarzywania i skutkow, wydaje mi sie ze jest to chyba wszystkim, zwlaszcza mlodym ludziom dobrze znany temat
Chciałabym prosić o zainteresowanie się
sprawą w dzielnicy Władysława Jagiełły w Łodzi. W bloku nr. 13b w klatce 6
prusaki oraz kalakruchy chodzą po mieszkaniach. Winę za to ponosi lokator z 9 piętra. Spłódzielnia niejednokrotnie była o tym informowana, ale bezskutecznie!!!
Proszę o pomoc! Ul. Łagiewnicka 102/116
blok 13b klatka 6.
jak dlugo po zazyciu amfy jest ona wykrywalna w moczu i we krwi?slyszalem,ze amfetamina rozpuszcza sie w wodzie i jest szybko wydalana przez organizm.
jak dlugo po zazyciu amfy jest ona wykrywalna w moczu i we krwi?slyszalem,ze amfetamina rozpuszcza sie w wodzie i jest szybko wydalana przez organizm.