TALK - Rozmowy [H]

[Darksouled]

Z PRAKTYKI
Zastosowanie wysoko sprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w analizie kannabinoli

Nowa Ustawa o przeciwdziałaniu narkomanii" z dnia 24.04.1997 r. (DzU nr 75/1997 póz. 468) wśród licznych zmian, jakie wprowadziła (m.in. zawie­ra wykazy prekursorów, wprowadziła karalność posiadania substancji obję­tych kontrolą prawną-wyłączając ma­łe dawki na własne potrzeby, podaje definicję środka zastępczego), naj­ważniejszą wydaje się podział roślin maku i konopi. mak dzielimy na nisko-morfinowy, w którym zawartość morfi­ny nie przekracza 0,06%, i wysoko-morfinowy.
Natomiast spośród roślin konopi ustawa wydzieliła konopie włókniste -rośliny z gatunku konopie siewne (Cannabis sativa) o zawartości delta 9-tetrahydrokannabinolu poniżej 0,3% w suchej masie (art. 6 ust. 19). Zapis ten obliguje do wskazania, które rośli­ny są rolniczo użyteczne, a które na­dają się do wyrobu narkotyków. Takie rozróżnienie roślin wymuszane jest również przez art. 32 ust. 3 i 4 ww. ustawy. W punkcie 3 mowa jest o wa­runkach uprawy konopi włóknistych, natomiast punkt 4 art. 32 zakazuje uprawy innych konopi niż konopie włókniste. Ponadto art. 49 ust. 1 i 2 przewiduje karę pozbawienia wolności do lat 2, ograniczenia wolności albo grzywny za uprawę innych konopi niż włókniste lub zbiór żywicy i ziela kono­pi wbrew przepisom ustawy. Natomiast zgodnie z art. 51 uprawa konopi włóknistych wbrew przepisom ustawy podlega karze grzywny .
Konopie dzięki swoim cechom biologicznym znalazły zastosowanie w przemyśle włókienniczym, technicz­nym, papierniczym. Jednak niektóre ich gatunki wykorzystywane sądo produkcji środków narkotycznych.
W konopiach obok składników po­wszechnie znajdujących się w rośli-
nach występuje ponad 60 kannabinoi-dów, w tym okoto 15 kannabinoli . Mimo wielu czynników wpływających na zawartość i skład kannabinoidów w roślinie, m.in. czynników środowisko­wych - zwłaszcza klimatycznych, wa­runków agrotechnicznych, fazy roz­wojowej roślin, stopnia jednopienno-ści, niewątpliwie największe znacze­nie mają właściwości genetyczne ko­nopi. Zawartość tetrahydrokannabino-lu (THC) w zależności od ww. czynni­ków może się wahać od 0,001% do 5%, a nawet do 10%. Również w po­szczególnych częściach rośliny wy­stępują znaczne różnice zawartości THC. W wyniku przeprowadzonych badań w łodygach nie stwierdza się jego obecności. Natomiast liście wie­chy zawierają ok. 1%, kwiatostan ok. 3%, a żywica ok. 5% tetrahydrokanna-binolu .
Obecnie przyjmuje się, że konopie należą do jednego rodzaju i gatunku konopi siewnych Cannabis sativa, któ­re dzielą się na trzy podgatunki:

- konopie dzikie,
- konopie narkotyczne,
- konopie zwyczajne.

Konopie dzikie: charakteryzują się grubą okrywą owoców, łatwością osy­pywania się nasion. Rośliny te należą do stosunkowo niskich. Nasiona ich są drobne, ciemno zabarwione o bardzo wzorzystej mozaice. Zawartość włók­na jest niska, natomiast zawartość THC sięga nieraz 0,5%, a nawet 1%. Rośliny te można spotkać w Azji (In­die, Iran, Afganistan, Chiny). W Euro­pie występują w Polsce, Czechach, Słowacji i krajach Półwyspu Bałkań­skiego.
Konopie narkotyczne: dwupien-ne, typowo odurzające. Rośliny mają silnie rozgałęzioną łodygę o gęstym i obfitym ulistnieniu. Odcinki liściowe są małe, intensywnie zielone. Konopie narkotyczne mają mało włókna. Sub­stancje odurzające otrzymuje się z osobników żeńskich. Listki wiechy gło-wacza pokryte są gruczołami włosko-watymi wydzielającymi intensywny za­pach kannabinolowy oraz lepką sub­stancją zwaną żywicą. Konopie te na-leżądo typu południowego. Występują w Indiach i wszystkich krajach sąsied­nich. W Polsce nie dojrzewają, mogą jednak być krzyżowane ze wszystkimi rosnącymi u nas typami konopi.
Konopie zwyczajne: wyróżniają się ogromnym bogactwem form. Wśród nich występują konopie połu­dniowe, północne oraz konopie po­średnie.
- Konopie pośrednie - do tej grupy należą m.in. konopie polskie oraz środkoworosyjskie. Najczęściej wyso­kość łodygi wynosi od 125 cm do 200 cm, często dochodzi nawet do 250 cm i więcej. Liść większy niż u konopi północnych. W środkowej części skła­da się z 7 odcinków. Nasiona jasne bez mozaiki.
- Konopie południowe - do tej grupy zalicza się konopie francuskie, hisz­pańskie, jugosłowiańskie, włoskie, tu­reckie. Najczęściej wysokość łodygi wynosi od 250 cm do 400 cm. Liście mają duże, szerokie, składające się z 9-11 odcinków. Nasiona duże, barwy szarej lub ciemnoszarej z wyraźnie za­znaczoną mozaiką. W Polsce konopie te w zasadzie nie dojrzewają ,
Wobec łatwości tworzenia się krzy­żówek wszystkie występujące typy i formy konopi mogą się ze sobą krzy­żować.
Do wstępnych prac selekcyjnych wykorzystuje się niektóre cechy biolo-giczno-morfologiczne konopi:
- stopień jednopienności - wszy­stkie rośliny jednopienne o zbliżonym do płaskoni (osobniki męskie) pokroju wykazują niską zawartość kannabinoli CBD, THC, CBN. Zawartość ta wy­raźnie wzrastała w miarę zbliżania się do pokroju głowacza (osobniki żeń­skie). Znane jest zjawisko, iż konopie jednopienne po 2-3 latach uprawy upodabniają się do konopi dwupien-nych (mających na jednych okazach kwiaty pręcikowe, a na innych kwiaty słupkowe). Wówczas to wzrasta za­wartość kannabinoli w roślinie,
- intensywność zapachu, lepkość wiechy oraz wzrost gruczołów wy-dzielniczych na listkach wiechy - związane są nierozerwalnie ze wzrostem zawartości THC w badanej próbce.
Jak powszechnie wiadomo, tetra-hydrokannabinol jest najsilniej działa­jącym farmakologicznie związkiem odpowiedzialnym za właściwości psy­chotropowe konopi. Jego działanie wzrasta 3-4-krotnie, jeżeli jest stoso­wany wziewnie, a nie doustnie . tetrahydrokannabinol (THC) wystę­puje najczęściej łącznie z kannabi-diolem (CBD) i kannabinolem (CBN). Powszechnie uważa się, że te dwa ostatnie związki, mimo iż same nie wykazują odurzającego działania, to wzmagają skutki działania delta 9-te-trahydrokannabinolu. Według dotych­czasowych badań przyjmuje się, że substancją wyjściową do przemian kannabinoli jest kwas kannabidiolowy. Kwas ten w procesie dekarboksylacji przechodzi w kannabigerol i kannabi-diol. Kannabidiol w wyniku przemiany wewnątrzcząsteczkowej przechodzi w tetrahydrokannabinol. Ostatnim eta­pem w procesie przemian kannabinoli jest redukcja tetrahydrokannabinolu do kannabinolu (ryć. 1) [3].
Zasadnicze znaczenie w procesie syntezy kannabinoli mają uwarunko­wania genetyczne rośliny. Jednak przebieg procesu w dużym stopniu za­leży od temperatury i naświetlenia. Przeprowadzone badania potwierdza­ją, że biosynteza kannabinoli zostaje zakłócona lub wręcz zahamowana, je­żeli w roślinie pojawi się dominacja kannabigerolu (CBG). Tak więc bada­nia genetyczne zmierzają w kierunku wyhodowania takich odmian konopi, w
których proces biosyntezy będzie za­trzymywany" na etapie CBG i CBD. Spowoduje to, iż wraz z dojrzewaniem rośliny (jak wiadomo dojrzewanie jest związane ze wzrostem THC w roślinie) nie będzie dochodziło do wzrostu THC lub będzie on niewielki. Ponadto we­dług dotychczasowego stanu wiedzy kannabigerol nie ma właściwości psy­chotropowych, tak więc wzrost jego stężenia w roślinie nie będzie miał nie­korzystnego wpływu na organizm ludzki [3].
Biorąc pod uwagę zawartość delta 9-tetrahydrokannabinolu oraz kanna-bidiolu (poprzedzającego THC w cyklu przemian) wydzielono trzy najważniej­sze chemotypy konopi. Podziałowi te­mu sprzyja fakt, że każda pojedyncza roślina należy do określonego typu chemicznego w ciągu całego swojego cyklu rozwojowego.

l chemotyp
Typ narkotyczny - wybitnie odurza­jący
delta 9-THC > 2%, CBD = 0%
Występuje w klimacie gorącym. Do tej grupy zaliczamy konopie indyjskie, meksykańskie, południowoafrykań­skie.

II chemotyp
Typ pośredni - również odurzający delta 9-THC > 0,5% (średnio od 0,3% do 0,9%), CBD > 0,5%
Są to wszystkie konopie uprawiane w klimacie ciepłym, śródziemnomor­skim.

III chemotyp
Konopie włókniste
delta 9-THC < 0,3%, CBD > 0,5%
Do tej grupy należą konopie upra­wiane w strefie umiarkowanej.
Wysokie stężenie CBD, przy sprzy­jających warunkach uprawy, może spowodować, iż u rośliny typu włókni­stego zostanie przekroczona bezpie­czna granica dla delta 9-THC. Zdarza się to przy prowadzeniu kilkuletnich odsiewów w warunkach sztucznych (szklarniowych przy odpowiednio stworzonych warunkach agrotechnicznych). Wówczas stężenie THC mo­że przekroczyć granicę 0,3% i roślina taka, mimo iż jej profil nie odbiega zasadniczo od typu włóknistego, ze względu na zawartość THC zostanie zakwalifikowana do typu narkotyczne­go. W związku z tym dąży się do wy­hodowania konopi całkowicie bezpie­cznych, o bardzo niskiej zawartości THC. Badania takie są już prowadzo­ne, a osiągnięte wyniki pozwalają wy­różnić wstępnie IV chemotyp konopi.
IV chemotyp
delta 9-THC ok. 0,001%, CBD ok. 0,02%
Ustawa o przeciwdziałaniu narko­manii z dnia 24.04.1997 r. przy wy­dzielaniu gatunku konopi włóknistych spośród całego rodzaju konopi posłu­żyła się ww. podziałem, tj. oznacza­niem stężenia delta 9-THC. W litera­turze można jednak spotkać również inny współczynnik umożliwiający roz­różnianie typu włóknistego od typu na­rkotycznego konopi, tzw. kryterium proporcji kannabinoli:

CBN% + THC% / CBD%

[Darksouled]

Jeżeli PC < 1, to konopie zalicza się do typu włóknistego. Jeżeli PC > 1, wtedy mamy do czynienia z konopiami typu narkotycznego [3J.
Kryterium to wprowadzono biorąc za podstawę cykl przemian kannabi­noli, jaki zachodzi w roślinie. Jak wia­domo, w młodych okazach występuje wysokie stężenie CBD, natomiast za­wartość THC jest niewielka. Dopiero w okresie dojrzewania konopi dochodzi do uaktywnienia się procesu biosynte­zy kannabinoli, co wiąże się ze wzro­stem THC w roślinie. Dłuższe prze­chowywanie i suszenie roślin powodu­je rozkład THC do CBN, w wyniku którego następuje spadek stężenia delta 9-THC.
Oznaczanie ilościowe delta 9-THC
Przygotowanie próbek
Jeżeli do badań trafiał materiał jec norodny, rozdrobniony, to poddawan go homogenizacji - wytrząsaniu v opakowaniu, w którym się znajdowa; a następnie z tak przygotowanego ma teriału pobierano próbkę do badań.
W przypadku dużych opakowar materiału stosowano metodę pryzma towania. Gdy do badań nadsyłano ca­łe rośliny, do oznaczeń pobierane szczytową część wiechy (ok. 10-15 cm). Jeżeli do badań dostarczano ha­szysz, próbkę do badań pobierano po jego uprzednim rozdrobnieniu. Bada­ne próbki suszono w temperaturze po­kojowej (około 20°C) przez 2-3 dni. W razie konieczności próbki suszono w suszarce w temperaturze 25°C (przy otwartych drzwiach suszarki w celu zapewnienia dobrej cyrkulacji powie­trza). Tak wysuszony materiał przesie­wano przez sito o oczkach 400 jam, a następnie pobierano naważki w ilości od 0,05-0,150 g (w zależności od ilo­ści materiału dostarczonego do ba­dań). Badaną próbkę ekstrahowano mieszaniną metanol: chloroform (9:1) w ilości 5 cm3. Otrzymane ekstrakty przesączano przez bibułę filtracyjną.
Aparatura
Zastosowano chromatograf cieczo­wy firmy Perkin Elmer, detektor UV/VIS, kolumnę C-18 ODS-2 o dłu­gości 25 cm i średnicy 0,46 cm firmy Waters wypełnioną żelem krzemion­kowym o średnicy ziarna 5 jam. Do zobrazowania wyników stosowano in­tegrator.
Wykonanie analizy
Badania prowadzono w układzie odwróconych faz. Zastosowano fazę ruchomą, tzn. mieszaninę metanolu i 0,1% kwasu fosforowego (75:25).
Podczas badań stosowano gradient linearny. Skład eluentu (metanol : 0,1 % kwas fosforowy) zmieniał się od­powiednio od 75:25 do 90:10 w ciągu 25 minut, a następnie utrzymywał się na takim poziomie przez 10 minut.

Warunki analizy
Przepływ 1 ml/min; Temperatura 35°C; Detekcja UV/VIS, długość fali - 230 nm;
Czułość detektora 0,001 a.u.f.s; Wielkość próbki 10 (ii.
Interpretacja wyników
Chromatogram przedstawiony na rycinie 2 jest typowym chromatogra-mem konopi włóknistych. Pojawiający się charakterystyczny pik o czasie re­tencji Rt = 16,00 min pochodzi najpra­wdopodobniej od kannabigerolu (CBG). Analiza chromatogramów ko­nopi włóknistych pozwala wysnuć wniosek, że wzrost stężenia kannabi­gerolu w próbce powoduje spadek w niej stężenia delta 9-tetrahydrokanna-binolu.
Ponadto próbki pochodzące z kono­pi włóknistych charakteryzują się zwiększoną zawartością kannabidiolu (CBD) w stosunku do kannabinolu (CBN) i delta 9-tetrahydrokannabino-lu.
Chromatogramy konopi włóknistych odznaczają się zwiększoną liczbą re­jestrowanych związków niż chromato-gramy konopi narkotycznych.
Rycina 3 obrazuje chromatogram konopi narkotycznych.
Chromatogram ten charakteryzuje się znacznym wzrostem piku pocho­dzącego od delta 9-tetrahydrokanna-binolu (delta 9-THC). W chromatogra-mach próbek pochodzących z konopi narkotycznych typowe jest występo­wanie kannabigerolu (CBG) w mini­malnym stężeniu. W konopiach narko­tycznych w większym stężeniu wystę­puje kannabinol (CBN) niż kannabidiol (CBD). W próbkach pochodzących z
konopi narkotycznych występuje mniejsza liczba związków (chromato-gramy są bardziej czyste").
Analizę ilościową przeprowadzono metodą wzorca zewnętrznego. Koń­cowe stężenie kannabinoli odczytywa­no z krzywej wzorcowej, korzystając z opcji integratora.
Podsumowanie
Przedstawiona metoda pozwala oz­naczać kannabinole w różnym mate­riale (rośliny konopi, marihuana, ha­szysz). Przygotowanie próbek do ana­lizy jest bardzo proste. Badany mate­riał nie wymaga skomplikowanych za­biegów, np. derywatyzacji.
Ustalone parametry analizy umożli­wiają identyfikację poszczególnych kannabinoli (CBG, CBD, THC, CBN) na podstawie ich czasów retencji.
Przy zastosowaniu metody kalibra­cji bezwzględnej oraz korzystając z opcji integratora dokonuje się ozna­czeń ilościowych delta 9-THC w bada­nej próbce.
Przedstawiona metoda umożliwia pełne rozróżnianie próbek pochodzą­cych z konopi włóknistych od próbek pochodzących z konopi narkotycz­nych.
Radosław Jądrzak Marcin Biskupski

BIBLIOGRAFIA
1. Ustawa o przeciwdziałaniu narkomanii z dnia 24.04.1997 r.
2. Kurhański M., Kurhańska-Chrosto-wska G.: Czynniki wpływające na za­wartość kannabinoidów w konopiach. Instytut Włókien Naturalnych, Poznań 1995.
3. Kurhański M., Kurhańska-Chrosto-wska G.: Przyrodnicze podstawy uzy­skania konopi nienarkotycznych. Insty­tut Włókien Naturalnych, Poznań 1995.
4. Seńczuk W.: Toksykologia. PZWL, Warszawa 1994.