W LABORATORIUM BIOCHEMIKA
Pierwszy alkaloid, morfinę, wyodrębnił Serturner z opium w roku 1804. Niemal trzydzieści lat później, w roku 1831, J. Liebig podał dla tego związku wzór sumaryczny C17H19O3N. Ale upłynął prawie wiek cały, gdy w roku 1923 Robinson zaproponował budowę, strukturalną morfiny. Upłynęło znów ponad 30 lat, gdy chemicy w 1956 roku potwierdzili jej budowę, dokonując pełnej syntezy tego związku chemicznego. W sumie trzeba było czekać aż 125 lat, by móc powiedzieć z całą pewnością, że cząsteczka morfiny jest zbudowana z czterech pierwiastków reprezentowanych przez czterdzieści atomów rozmieszczonych w przestrzeni w dość osobliwy sposób.
Pierwszą wzmiankę o zastosowaniu skutecznego leku przeciwmalarycznego, którym była sproszkowana kora chinowa, spotykamy w roku 1693. Trzeba było jednak odczekać niemal 130 lat na wyodrębnienie z niej istotnego składnika chininy, czego dokonali francuscy aptekarze Pelletier i Caventou w roku 1820. II lat potem słynny Liebig wykonał analizę ilościową i podał sumaryczny wzór chininy.
C20H24N2O2. Ale upłynął znów cały wiek, gdy w roku 1944 Woodward otrzymał ten związek na drodze wieloetapowej syntezy, potwierdzając tym jego strukturę chemiczną.
Wspaniały rozwój chemii pozwala obecnie na wyizolowanie czynnej substancji, ustalenie jej budowy chemicznej i dokonanie nie tylko pełnej syntezy, ale również korzystnych modyfikacji cząsteczki - w przeciągu kilku lat. Przez długie wieki chemicy opracowali wiele skutecznych metod uzyskiwania stężonych roztworów zawlerających substancję czynną. Odpowiednio przygotowany surowiec roślinny lub zwierzęcy najczęściej ługowali wodą, słabymi roztworami kwasów lub zasad, alkoholem, a także tłuszczami, prawie zawsze w podwyższonych temperaturach. Poddawali go też procesowi destylacji, wytapiania lub wyciskania. Otrzymane w ten sposób nalewki, wyciągi i destylaty do dziś są stosowane jako doskonałe leki, choć zawierają one wiele substancji ubocznych, zwykle mało aktywnych Iub całkowicie nieczynnych.
Po odparowaniu uzyskanych roztworów i kolejnym traktowaniu powstałego osadu różnymi rozpuszczalnikami, a następnie przez wielokrotną krystalizację otrzymywano wreszcie substancję zasadniczą w postaci czystej. Substancje fizjologicznie czynne spotyka się w surowcach naturalnych często w znikomych stężeniach i do tego w obecności wielu związków o różnorodnej budowie chemicznej. Do niedawna izolowanie tych substancji i ich dostateczne oczyszczanie połączone było z wielokrotnym powtarzaniem opisanych zabiegów, co w końcu powodowało wielkie straty, a co najgorsze - zmiany chemiczne, a więc utratę aktywności biologicznej. Z tego też powodu chemicy byli zmuszeni do opracowania coraz to bardziej subtelnych metod działania.
Ogromnym postępem w pracach biochemicznych było wprowadzenie tzw. metod chromatograficznych, których zasady rozdzielania polegają na różnicach fizykochemicznych uzyskiwanej substancji i materiałów użytych do jej izolowania. Wykorzystuje się tu np. różnicę wielkości cząsteczek. Jeśli badany materiał przepuszcza się przez rurę napełnioną odpowiednip dobranym porowatym materiatem, to zatrzyma on w swych porach mniejsze cząsteczki silniej niż większe. W innym rodzaju chromatografii wykorzystuje się wzajemne oddziaływanie elektrostatyczne między materiałem zapełniającym rurę szklaną a odmiennie naładowanymi cząsteczkami izolowanej substancji.
Ostatnie lata przyniosły rewelacyjny sposób oczyszczania chromatograficznego, który otworzył nowe drogi w badaniach biochemicznych. Jest on oparty na spostrzeżeniu, iż biomakrocząsteczki mogą tworzyć z innymi cząsteczkami specyficzne związki, zwane kompleksowymi, ulegające łatwemu rozkładowi.
Schematyczny rysunek odzwierciedlający istotę metody ukazuje, że jedynie określona substancja z badanego roztworu może związać się z nośnikiem. Substancje towarzyszące o odmiennej budowie nie są wychwytywane. W końcowej fazie procesu, przez zmianę temperatury, kwasowości lub stężenia roztworu rozbija się kompleks nośnika i danej substancji, którą następnie wypłukuje się z kolumny. Podczas badań początkowych zastosowano jako nośnik skrobię do wychwytywania enzymów.
Obecnie stosuje się syntetyczne związki wielocząsteczkowe. O skuteczności tego postęPowania świadczy przykład: Starymi metodami izolowano z bakterii przez wi~lostopniowe oczyszczanie enzym asparaginazę, niestety o niskim stopniu aktywności. Dzięki nowej metodzie wyizolowano w postęPowaniu jednorazowym ten sam enzym o aktywności trzydziestokrotnie większej, Opisaną metodą uzyskano nie tylko enzymy o olbrzymim stopniu aktywności, lecz wyizolowano również antyciała, antygeny, a nawet wirusy, co przy dawnych metodach postępowania nie zawsze było możIiwe do przeprowadzenia.
W jaki sposób chemik określa, że otrzymana i oczyszczona przez niego substancja jest "chemicznie czysta", czyli całkowicie jednorodna? Za kryterium tej czystości uznaje on najczęściej ustalenie jakiejś wartości fizycznej, np. punktu topnienia lub wrzenia, współczynnika załamania światła itd. Gdy okaże się, że wyizolowana substancja ma np. stały, nie zmieniający się punkt topliwości, przystępuje się do określenia jej składu poprzez spalenie próbki odważonej z wielką dokładnością, sięgającą zwykle jednej dziesięciotysięcznej grama. Jeśli substancja zawiera węgiei, to po spaleniu powstanie dwutlenek węgla, który można łatwo wychwycić w roztworze zasady i przez zważenie naczynia oznaczyć jego masę. Gdy substancja zawiera pierwiastek wodór, to po spaleniu powstanie woda, którą również łatwo można wyłapać w naczyniu z materiałem higroskopijnym, czyii chciwie wchłaniającym wilgoć, a następnie przez zważenie oznaczyć jej masę, Prostym sposobem można teraz obliczyć procentową zawartość pierwiastków w badanej próbce.
Przypuśćmy, że badana substancja zawierała 40% węgla, 6,7% wodoru i 53,3% tlenu. Jeśli podzielimy otrzymane liczby przez odpowiednie masy atomowe, otrzymamy stosunek atomów poszczególnvch pierwiastków w cząsteczce.
C 40/12 = 3,33
12H 6,7/1,008 = 6,66
O 53,3/16 = 3,33
Po sprowadzeniu otrzymanych wartości do liczb całkowitych otrzymamy następujący stosunek atomów węgla, wodoru i tlenu: 1:2:1.
Możemy już teraz napisać najprostszy wzór sumaryczny CH2O który jednak nie odzwierciedla stanu rzeczywistego, gdyż substancja może mieć wprawdzie wzór CH2O, ale również C2H4O2 Iub C3H603 itd.
Przeprowadzając substancję w stan pary i oznaczając jej gęstość w porównaniu z gęstością wodoru można z łatwością obliczyć jej masę cząsteczkową, Załóżmy, że masa ta jest równa 60, wobec czego możemy już napisać rzeczywisty wzór sumaryczny: C2H4O2.
Ale nie koniec na tym. Okazało się bowiem, że istnieją aż trzy substancje chemiczne o różnych właściwościach fizycznych i chemicznych, których cząsteczka składa się z dwóch atomów węgla, czterech atomów wodoru i dwóch atomów tlenu, związanych jednak ze sobą w różnej kolejności i rozmieszczonych rozmaicie w przestrzeni. Zjawisko to chemicy nazwali izomerią, a związki o tym samym wzorze sumarycznym - izomerami.
Następna czynność to określenie uporządkowania atomów w cząsteczce, czyli ustalenie jej wzoru strukturalnego. Dla wyklarowania struktury związku należy przebadać jego zachowanie się w różnych reakcjach chemicznych, zwłaszcza prowadzących do powstania innych, znanych już substancji. Na podstawie licznych i różnorodnych reakcji można wreszcie zbudować model strukturalny. Załóżmy, że nasza substancja wykazuje w roztworze wodnym odczyn kwaśny i łatwo tworzy sole z wodorotlenkami. Możemy teraz powiedzieć, że badaną substancją jest kwas octowy CH3COOH.
I to jeszcze nie koniec pracy chemika. Skoro już potrafił ustalić wzór strukturalny badanego związku, musi następnie sprawdzić, czy aby nie pomylił się w swym rozumowaniu i postępowaniu. Sprawdzianem jest całkowita synteza badanego związku ze znanych dobrze substancji prostych. W naszym przypadku byłaby to synteza kwasu octowego, a substancją pierwotną dobrze znany chemikom węglowodór o dwóch atomach węgla - etan. Gdy i ta próba wypadła pomyślnie, model strukturalny może być uważany za zgodny z rzeczywistością.
Teraz uświadamiamy sobie, jak trudną i długotrwałą pracę musi wykonać chemik, zanim określi budowę chemiczną badanego związku.
Nasz przykład z kwasem octowym był wyjątkowo prosty. Zrozumiemy teraz, jakiego wyczynu dokonali chemicy, kiedy uzyskali w stanie czystym morfinę, Określili jej skomplikowany wzór sumaryczny C17H19O3N, a wreszcie ustalili jeszcze bardziej skomplikowany wzór strukturalny. Nie dziwmy się teraz, że badania trwały łącznie aż 125 lat.
Od prawie 40 lat chemicy wprowadzili, obok wypracowanych metod badania chemicznego, metody fizyczne, co ogromnie uprościło i przyspieszyło ich badania nad strukturą zvyiązków chemicznvch. Chemik bada więc teraz widma danego związku w promieniach podczerwonych i nadfiołkowych. Okazało się, że badanie absorpcji światła umożliwia wgląd w stan wiązań cząsteczek.
Pochłanianie światła w zakresie widzialnym oraz podczerwonym i nadfiołkowym zależy od struktury elektronowej cząsteczek, co wiąże się ściśle z właściwościami chemicznymi substancji. Przeprowadza się też ważne próby polegające na ugięciu się promieni rentgenowskich przez kryształy danego związku lub wykorzystuje się do wyklarowania struktury spektroskopię masową.
Zwłaszcza ta ostatnia metoda stała się przydatna w badaniach, upraszczając je ogromnie i skracając ich czas do dni, a nawet godzin. Przy jej zastosowaniu możemy szybko określić wzór sumaryczny substancji oraz jej masę cząsteczkową, a także ugrupowania atomów w cząsteczce. I jeszcze dochodzi do tego jedna korzyść. O ile w zwykłych badaniach chemicznych masę substancji wyraża się w gramach, o tyle w opisywanej metodzie potrzebne ilości są niezwykle małe, gdyż wahają się w granicach 10exp-4 ... 10exp-8 grama, a więc sprowadzają się do ledwie zauważalnych pyłków. Jest to specjalnie ważne dla substancji występujących w organizmach żywych odgrywających zasadniczą rolę w jego funkcjonowaniu, jak np. enzymy lub hormony.
Wielką trudnością w opisywanym badaniu jest przeprowadzenie substancji w stan lotny bez jej rozkładu. Parę badanego związku bombarduje się strumieniem elektronów o energii około 70 eV. podczas tych zderzeń cząsteczki tracą elektron i stają się jonami dodatnimi, Cząsteczka obojętna +e-+ jon+ +2e.
Wytworzoną chmurę jonów przyspiesza się w polu elektrycznym i przeprowadza się ją przez układ rozdzielający jony o różnej masie.
Chemik specjalista bez większego trudu potrafi z zaszyfrowanego rozkładu jonów określić ich masę, częstość występowania oraz strukturę fragmentów cząsteczki.
Wyizolowanie czynnej substancji z produktów naturalnych, określenie jej struktury i synteza, to dopiero jeden rozdział pracy chemika zajmującego się przygotowywaniem leków.
Następny etap to modyfikacja, czyli częściowa zmiana struktury cząsteczki, prowadząca do otrzymania substancji mniej toksycznej i o korzystniejszym oddziaływaniu leczniczym. Praca na tym odcinku jest żmudna, długa oraz wymaga współpracy wielu ludzi o różnych specjalnościach. Przy poszukiwaniu pewnego skutecznie działającego środka bakteriostatycznego zespół specjalistów przebadał wstępnie kilkadziesiąt tysięcy różnych preparatów.
Do dalszych prób wyselekcjonowano zaledwie 200 substancji, z których tylko 30 poddano ścisłym badaniom. Z tej trzydziestki jedynie sześć preparatów przeznaczono do badań klinicznych.
Współczesna wiedza daje możność przewidywania struktury chemicznej związków o żądanych właściwościach farmakologicznych, toteż otworzył się jeszcze jeden rozdział pracy dla chemika poszukującego skutecznych leków wśród związków nie występujących w naturze, lecz syntetyzowanych w laboratorium.
Znamy obecnie ponad 7 milionów substancji chemicznych, a ich coroczny przyrost wynosi około 250 tysięcy. Jakież pole do popisu ma biochemii! Czy jednak będziemy mieli teraz odwagę nazwać jego mrówczą pracę poszukiwaniem igły w stogu siana? Z pewnością to porównanie nie odzwierciedla już trudów ponoszonych przy poszukiwaniu nowych leków.
Zdumiałby się z pewnością Glauber tym skomplikowaniem sytuacji, którego "cudowną sól" o silnych własnościach przeczyszczających, zalecano powszechnie jako lek niemal uniwersalny.