Zastosowanie wysoko sprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w analizie kannabinoli
Nowa Ustawa o przeciwdziałaniu narkomanii" z dnia 24.04.1997 r. (DzU nr 75/1997 póz. 468) wśród licznych zmian, jakie wprowadziła (m.in. zawiera wykazy prekursorów, wprowadziła karalność posiadania substancji objętych kontrolą prawną-wyłączając małe dawki na własne potrzeby, podaje definicję środka zastępczego), najważniejszą wydaje się podział roślin maku i konopi. mak dzielimy na nisko-morfinowy, w którym zawartość morfiny nie przekracza 0,06%, i wysoko-morfinowy.
Natomiast spośród roślin konopi ustawa wydzieliła konopie włókniste -rośliny z gatunku konopie siewne (Cannabis sativa) o zawartości delta 9-tetrahydrokannabinolu poniżej 0,3% w suchej masie (art. 6 ust. 19). Zapis ten obliguje do wskazania, które rośliny są rolniczo użyteczne, a które nadają się do wyrobu narkotyków. Takie rozróżnienie roślin wymuszane jest również przez art. 32 ust. 3 i 4 ww. ustawy. W punkcie 3 mowa jest o warunkach uprawy konopi włóknistych, natomiast punkt 4 art. 32 zakazuje uprawy innych konopi niż konopie włókniste. Ponadto art. 49 ust. 1 i 2 przewiduje karę pozbawienia wolności do lat 2, ograniczenia wolności albo grzywny za uprawę innych konopi niż włókniste lub zbiór żywicy i ziela konopi wbrew przepisom ustawy. Natomiast zgodnie z art. 51 uprawa konopi włóknistych wbrew przepisom ustawy podlega karze grzywny .
Konopie dzięki swoim cechom biologicznym znalazły zastosowanie w przemyśle włókienniczym, technicznym, papierniczym. Jednak niektóre ich gatunki wykorzystywane sądo produkcji środków narkotycznych.
W konopiach obok składników powszechnie znajdujących się w rośli-
nach występuje ponad 60 kannabinoi-dów, w tym okoto 15 kannabinoli . Mimo wielu czynników wpływających na zawartość i skład kannabinoidów w roślinie, m.in. czynników środowiskowych - zwłaszcza klimatycznych, warunków agrotechnicznych, fazy rozwojowej roślin, stopnia jednopienno-ści, niewątpliwie największe znaczenie mają właściwości genetyczne konopi. Zawartość tetrahydrokannabino-lu (THC) w zależności od ww. czynników może się wahać od 0,001% do 5%, a nawet do 10%. Również w poszczególnych częściach rośliny występują znaczne różnice zawartości THC. W wyniku przeprowadzonych badań w łodygach nie stwierdza się jego obecności. Natomiast liście wiechy zawierają ok. 1%, kwiatostan ok. 3%, a żywica ok. 5% tetrahydrokanna-binolu .
Obecnie przyjmuje się, że konopie należą do jednego rodzaju i gatunku konopi siewnych Cannabis sativa, które dzielą się na trzy podgatunki:
- konopie dzikie,
- konopie narkotyczne,
- konopie zwyczajne.
Konopie dzikie: charakteryzują się grubą okrywą owoców, łatwością osypywania się nasion. Rośliny te należą do stosunkowo niskich. Nasiona ich są drobne, ciemno zabarwione o bardzo wzorzystej mozaice. Zawartość włókna jest niska, natomiast zawartość THC sięga nieraz 0,5%, a nawet 1%. Rośliny te można spotkać w Azji (Indie, Iran, Afganistan, Chiny). W Europie występują w Polsce, Czechach, Słowacji i krajach Półwyspu Bałkańskiego.
Konopie narkotyczne: dwupien-ne, typowo odurzające. Rośliny mają silnie rozgałęzioną łodygę o gęstym i obfitym ulistnieniu. Odcinki liściowe są małe, intensywnie zielone. Konopie narkotyczne mają mało włókna. Substancje odurzające otrzymuje się z osobników żeńskich. Listki wiechy gło-wacza pokryte są gruczołami włosko-watymi wydzielającymi intensywny zapach kannabinolowy oraz lepką substancją zwaną żywicą. Konopie te na-leżądo typu południowego. Występują w Indiach i wszystkich krajach sąsiednich. W Polsce nie dojrzewają, mogą jednak być krzyżowane ze wszystkimi rosnącymi u nas typami konopi.
Konopie zwyczajne: wyróżniają się ogromnym bogactwem form. Wśród nich występują konopie południowe, północne oraz konopie pośrednie.
- Konopie pośrednie - do tej grupy należą m.in. konopie polskie oraz środkoworosyjskie. Najczęściej wysokość łodygi wynosi od 125 cm do 200 cm, często dochodzi nawet do 250 cm i więcej. Liść większy niż u konopi północnych. W środkowej części składa się z 7 odcinków. Nasiona jasne bez mozaiki.
- Konopie południowe - do tej grupy zalicza się konopie francuskie, hiszpańskie, jugosłowiańskie, włoskie, tureckie. Najczęściej wysokość łodygi wynosi od 250 cm do 400 cm. Liście mają duże, szerokie, składające się z 9-11 odcinków. Nasiona duże, barwy szarej lub ciemnoszarej z wyraźnie zaznaczoną mozaiką. W Polsce konopie te w zasadzie nie dojrzewają ,
Wobec łatwości tworzenia się krzyżówek wszystkie występujące typy i formy konopi mogą się ze sobą krzyżować.
Do wstępnych prac selekcyjnych wykorzystuje się niektóre cechy biolo-giczno-morfologiczne konopi:
- stopień jednopienności - wszystkie rośliny jednopienne o zbliżonym do płaskoni (osobniki męskie) pokroju wykazują niską zawartość kannabinoli CBD, THC, CBN. Zawartość ta wyraźnie wzrastała w miarę zbliżania się do pokroju głowacza (osobniki żeńskie). Znane jest zjawisko, iż konopie jednopienne po 2-3 latach uprawy upodabniają się do konopi dwupien-nych (mających na jednych okazach kwiaty pręcikowe, a na innych kwiaty słupkowe). Wówczas to wzrasta zawartość kannabinoli w roślinie,
- intensywność zapachu, lepkość wiechy oraz wzrost gruczołów wy-dzielniczych na listkach wiechy - związane są nierozerwalnie ze wzrostem zawartości THC w badanej próbce.
Jak powszechnie wiadomo, tetra-hydrokannabinol jest najsilniej działającym farmakologicznie związkiem odpowiedzialnym za właściwości psychotropowe konopi. Jego działanie wzrasta 3-4-krotnie, jeżeli jest stosowany wziewnie, a nie doustnie . tetrahydrokannabinol (THC) występuje najczęściej łącznie z kannabi-diolem (CBD) i kannabinolem (CBN). Powszechnie uważa się, że te dwa ostatnie związki, mimo iż same nie wykazują odurzającego działania, to wzmagają skutki działania delta 9-te-trahydrokannabinolu. Według dotychczasowych badań przyjmuje się, że substancją wyjściową do przemian kannabinoli jest kwas kannabidiolowy. Kwas ten w procesie dekarboksylacji przechodzi w kannabigerol i kannabi-diol. Kannabidiol w wyniku przemiany wewnątrzcząsteczkowej przechodzi w tetrahydrokannabinol. Ostatnim etapem w procesie przemian kannabinoli jest redukcja tetrahydrokannabinolu do kannabinolu (ryć. 1) [3].
Zasadnicze znaczenie w procesie syntezy kannabinoli mają uwarunkowania genetyczne rośliny. Jednak przebieg procesu w dużym stopniu zależy od temperatury i naświetlenia. Przeprowadzone badania potwierdzają, że biosynteza kannabinoli zostaje zakłócona lub wręcz zahamowana, jeżeli w roślinie pojawi się dominacja kannabigerolu (CBG). Tak więc badania genetyczne zmierzają w kierunku wyhodowania takich odmian konopi, w
których proces biosyntezy będzie zatrzymywany" na etapie CBG i CBD. Spowoduje to, iż wraz z dojrzewaniem rośliny (jak wiadomo dojrzewanie jest związane ze wzrostem THC w roślinie) nie będzie dochodziło do wzrostu THC lub będzie on niewielki. Ponadto według dotychczasowego stanu wiedzy kannabigerol nie ma właściwości psychotropowych, tak więc wzrost jego stężenia w roślinie nie będzie miał niekorzystnego wpływu na organizm ludzki [3].
Biorąc pod uwagę zawartość delta 9-tetrahydrokannabinolu oraz kanna-bidiolu (poprzedzającego THC w cyklu przemian) wydzielono trzy najważniejsze chemotypy konopi. Podziałowi temu sprzyja fakt, że każda pojedyncza roślina należy do określonego typu chemicznego w ciągu całego swojego cyklu rozwojowego.
l chemotyp
Typ narkotyczny - wybitnie odurzający
delta 9-THC > 2%, CBD = 0%
Występuje w klimacie gorącym. Do tej grupy zaliczamy konopie indyjskie, meksykańskie, południowoafrykańskie.
II chemotyp
Typ pośredni - również odurzający delta 9-THC > 0,5% (średnio od 0,3% do 0,9%), CBD > 0,5%
Są to wszystkie konopie uprawiane w klimacie ciepłym, śródziemnomorskim.
III chemotyp
Konopie włókniste
delta 9-THC < 0,3%, CBD > 0,5%
Do tej grupy należą konopie uprawiane w strefie umiarkowanej.
Wysokie stężenie CBD, przy sprzyjających warunkach uprawy, może spowodować, iż u rośliny typu włóknistego zostanie przekroczona bezpieczna granica dla delta 9-THC. Zdarza się to przy prowadzeniu kilkuletnich odsiewów w warunkach sztucznych (szklarniowych przy odpowiednio stworzonych warunkach agrotechnicznych). Wówczas stężenie THC może przekroczyć granicę 0,3% i roślina taka, mimo iż jej profil nie odbiega zasadniczo od typu włóknistego, ze względu na zawartość THC zostanie zakwalifikowana do typu narkotycznego. W związku z tym dąży się do wyhodowania konopi całkowicie bezpiecznych, o bardzo niskiej zawartości THC. Badania takie są już prowadzone, a osiągnięte wyniki pozwalają wyróżnić wstępnie IV chemotyp konopi.
IV chemotyp
delta 9-THC ok. 0,001%, CBD ok. 0,02%
Ustawa o przeciwdziałaniu narkomanii z dnia 24.04.1997 r. przy wydzielaniu gatunku konopi włóknistych spośród całego rodzaju konopi posłużyła się ww. podziałem, tj. oznaczaniem stężenia delta 9-THC. W literaturze można jednak spotkać również inny współczynnik umożliwiający rozróżnianie typu włóknistego od typu narkotycznego konopi, tzw. kryterium proporcji kannabinoli:
CBN% + THC% / CBD%
Kryterium to wprowadzono biorąc za podstawę cykl przemian kannabinoli, jaki zachodzi w roślinie. Jak wiadomo, w młodych okazach występuje wysokie stężenie CBD, natomiast zawartość THC jest niewielka. Dopiero w okresie dojrzewania konopi dochodzi do uaktywnienia się procesu biosyntezy kannabinoli, co wiąże się ze wzrostem THC w roślinie. Dłuższe przechowywanie i suszenie roślin powoduje rozkład THC do CBN, w wyniku którego następuje spadek stężenia delta 9-THC.
Oznaczanie ilościowe delta 9-THC
Przygotowanie próbek
Jeżeli do badań trafiał materiał jec norodny, rozdrobniony, to poddawan go homogenizacji - wytrząsaniu v opakowaniu, w którym się znajdowa; a następnie z tak przygotowanego ma teriału pobierano próbkę do badań.
W przypadku dużych opakowar materiału stosowano metodę pryzma towania. Gdy do badań nadsyłano całe rośliny, do oznaczeń pobierane szczytową część wiechy (ok. 10-15 cm). Jeżeli do badań dostarczano haszysz, próbkę do badań pobierano po jego uprzednim rozdrobnieniu. Badane próbki suszono w temperaturze pokojowej (około 20°C) przez 2-3 dni. W razie konieczności próbki suszono w suszarce w temperaturze 25°C (przy otwartych drzwiach suszarki w celu zapewnienia dobrej cyrkulacji powietrza). Tak wysuszony materiał przesiewano przez sito o oczkach 400 jam, a następnie pobierano naważki w ilości od 0,05-0,150 g (w zależności od ilości materiału dostarczonego do badań). Badaną próbkę ekstrahowano mieszaniną metanol: chloroform (9:1) w ilości 5 cm3. Otrzymane ekstrakty przesączano przez bibułę filtracyjną.
Aparatura
Zastosowano chromatograf cieczowy firmy Perkin Elmer, detektor UV/VIS, kolumnę C-18 ODS-2 o długości 25 cm i średnicy 0,46 cm firmy Waters wypełnioną żelem krzemionkowym o średnicy ziarna 5 jam. Do zobrazowania wyników stosowano integrator.
Wykonanie analizy
Badania prowadzono w układzie odwróconych faz. Zastosowano fazę ruchomą, tzn. mieszaninę metanolu i 0,1% kwasu fosforowego (75:25).
Podczas badań stosowano gradient linearny. Skład eluentu (metanol : 0,1 % kwas fosforowy) zmieniał się odpowiednio od 75:25 do 90:10 w ciągu 25 minut, a następnie utrzymywał się na takim poziomie przez 10 minut.
Warunki analizy
Przepływ 1 ml/min; Temperatura 35°C; Detekcja UV/VIS, długość fali - 230 nm;
Czułość detektora 0,001 a.u.f.s; Wielkość próbki 10 (ii.
Interpretacja wyników
Chromatogram przedstawiony na rycinie 2 jest typowym chromatogra-mem konopi włóknistych. Pojawiający się charakterystyczny pik o czasie retencji Rt = 16,00 min pochodzi najprawdopodobniej od kannabigerolu (CBG). Analiza chromatogramów konopi włóknistych pozwala wysnuć wniosek, że wzrost stężenia kannabigerolu w próbce powoduje spadek w niej stężenia delta 9-tetrahydrokanna-binolu.
Ponadto próbki pochodzące z konopi włóknistych charakteryzują się zwiększoną zawartością kannabidiolu (CBD) w stosunku do kannabinolu (CBN) i delta 9-tetrahydrokannabino-lu.
Chromatogramy konopi włóknistych odznaczają się zwiększoną liczbą rejestrowanych związków niż chromato-gramy konopi narkotycznych.
Rycina 3 obrazuje chromatogram konopi narkotycznych.
Chromatogram ten charakteryzuje się znacznym wzrostem piku pochodzącego od delta 9-tetrahydrokanna-binolu (delta 9-THC). W chromatogra-mach próbek pochodzących z konopi narkotycznych typowe jest występowanie kannabigerolu (CBG) w minimalnym stężeniu. W konopiach narkotycznych w większym stężeniu występuje kannabinol (CBN) niż kannabidiol (CBD). W próbkach pochodzących z
konopi narkotycznych występuje mniejsza liczba związków (chromato-gramy są bardziej czyste").
Analizę ilościową przeprowadzono metodą wzorca zewnętrznego. Końcowe stężenie kannabinoli odczytywano z krzywej wzorcowej, korzystając z opcji integratora.
Podsumowanie
Przedstawiona metoda pozwala oznaczać kannabinole w różnym materiale (rośliny konopi, marihuana, haszysz). Przygotowanie próbek do analizy jest bardzo proste. Badany materiał nie wymaga skomplikowanych zabiegów, np. derywatyzacji.
Ustalone parametry analizy umożliwiają identyfikację poszczególnych kannabinoli (CBG, CBD, THC, CBN) na podstawie ich czasów retencji.
Przy zastosowaniu metody kalibracji bezwzględnej oraz korzystając z opcji integratora dokonuje się oznaczeń ilościowych delta 9-THC w badanej próbce.
Przedstawiona metoda umożliwia pełne rozróżnianie próbek pochodzących z konopi włóknistych od próbek pochodzących z konopi narkotycznych.
Radosław Jądrzak Marcin Biskupski
BIBLIOGRAFIA
1. Ustawa o przeciwdziałaniu narkomanii z dnia 24.04.1997 r.
2. Kurhański M., Kurhańska-Chrosto-wska G.: Czynniki wpływające na zawartość kannabinoidów w konopiach. Instytut Włókien Naturalnych, Poznań 1995.
3. Kurhański M., Kurhańska-Chrosto-wska G.: Przyrodnicze podstawy uzyskania konopi nienarkotycznych. Instytut Włókien Naturalnych, Poznań 1995.
4. Seńczuk W.: Toksykologia. PZWL, Warszawa 1994.
Opisała życie w Norwegii. "Narkotyki są tanie, a państwo opiekuńcze"
Jacht z kokainą o wartości 80 milionów funtów zmierzał w stronę Wielkiej Brytanii
Prawie tona „narkotyku klasy A” została znaleziona na jachcie płynącym z wysp karaibskich do Wielkiej Brytanii. Jej rynkowa wartość została oszacowana na 80 milionów funtów.
Handel narkotykami: Rynek odporny na COVID-19. Coraz większe obroty w internecie
Dynamika rynku handlu narkotykami po krótkim spadku w początkowym okresie pandemii COVID-19 szybko dostosowała się do nowych realiów, wynika z opublikowanego w czwartek (24 czerwca) przez Biuro Narodów Zjednoczonych ds. Narkotyków i Przestępczości (UNODC) nowego Światowego Raportu o Narkotykach.
Meksyk: Sąd Najwyższy zdepenalizował rekreacyjne spożycie marihuany
Sąd Najwyższy zdepenalizował w poniedziałek rekreacyjne spożycie marihuany przez dorosłych. Za zalegalizowaniem używki głosowało 8 spośród 11 sędziów. SN po raz kolejny zajął się tą sprawą, jako że Kongres nie zdołał przyjąć stosownej ustawy przed 30 kwietnia.